Mieszaninę reakcyjną następnie poddano analizie CML według GC / MS. Gdy wskazano, jon chlorkowy (Cl.), Mieloperoksydaza (MPO), L-seryna lub H2O2 (nadtlenek) zostały pominięte w kompletnym układzie mieloperoksydazy. Po 72-godzinnej inkubacji w 37 ° C, RNaza A eksponowana na mieloperoksydazę, L-serynę i mM H2O2 uzyskała> 5 mmol CML na mol lizyny. Ten poziom jest podobny do obserwowanego w RNase A eksponowanej na 250 mM glukozy przez 6 tygodni. 1,000 godzin (39). Te obliczenia sugerują, że aldehyd glikolowy wytwarzany przez mieloperoksydazę jest około 3000 razy skuteczniejszy niż glukoza przy wytwarzaniu CML. RNaza A zawiera 10 reszt p-aminowych na resztach lizyny dostępnych do reakcji. Zakładając, że mol H2O2 przekształcił mol L-seryny na aldehyd glikolowy i że mol aldehydu glikolowego wytworzył mol CML, każdy mol H2O2 wytworzył 2 mmol CML. W mieszaninie aminokwasów mieloperoksydaza wytwarza CML przez szlaki, które są zarówno zależne od L-seryny, jak i od niezależnej od L-seryny. Aby określić, czy mieloperoksydaza wytworzy CML w obecności innych aminokwasów, odsłoniliśmy RNazę A do układu enzymatycznego w buforze uzupełnionym fizjologicznymi stężeniami glukozy i mieszaniną 7 najobficiej dostępnych wolnych aminokwasów w osoczu (260. M L -glutaminian, 210 | jM L-alaniny, 200 | jM L-seryny, 175 | jM glicyny, 165 | jM L-waliny, 100 | jM L-proliny i 100 | jL-lizyny, pozycja 33). W tych eksperymentach wspólnie inkubowaliśmy wszystkie składniki układu reakcyjnego. Nadtlenek wytwarzano w sposób ciągły na niskim poziomie, stosując oksydazę glukozy i glukozę, aby zapewnić bardziej fizjologiczny poziom utleniacza. W tych warunkach wykryliśmy znaczny wzrost poziomu CML w RNase A eksponowanej na kompletny system mieloperoksydazy (Figura 6). Wytwarzanie CML wymagało mieloperoksydazy i oksydazy glukozowej; był hamowany przez katalazę i azydek, w wyniku czego w reakcji zachodzi H2O2 i mieloperoksydaza. Pominięcie L-seryny z mieszaniny aminokwasów zmniejszyło wydajność CML o około 70%. Wyniki te wskazują, że mieloperoksydaza wytwarza CML na RNazie A przy stężeniach aminokwasów w osoczu na drodze reakcji, która obejmuje HOCl i L-serynę. Ponieważ CML był również wytwarzany w nieobecności L-seryny, istnieją niezależne od L-seryny szlaki do tworzenia CML przez mieloperoksydazę. Figura 6 Wpływ aminokwasów osocza na tworzenie CML przez mieloperoksydazę. Kompletny system mieloperoksydazy (Complete, 30 nM mieloperoksydazy, 300 ng / ml oksydazy glukozy, 100 .g / ml glukozy) inkubowano przez 16 godzin w 37 ° C w buforze A uzupełnionym mg / ml RNazy A, 260 .M L -glutaminian, 210 | jM L-alaniny, 200 | jM L-seryny, 175 | jM glicyny, 165 | jM L-waliny, 100 | jM L-proliny i 100 | jL L-lizyny. Mieszaninę reakcyjną następnie poddano analizie pod kątem CML za pomocą wychwytu elektronów GC / MS z jonem ujemnym z wybranym monitoringiem jonów. Azydek sodu (azydek, 5 mM) lub katalaza (Kat; 400 nM) dodano, gdy to wskazano. Dolne 3 słupki przedstawiają reakcje kontrolne zawierające samą RNazę A lub suplementację katalazą lub oksydazą glukozy. G, glukoza; GO, oksydaza glukozy; MPO, mieloperoksydaza. Gdy inkubowano RNazę A przez 16 godzin w 37 ° C w buforze uzupełnionym 100. M aldehydem glikolowym i mieszaniną aminokwasów, wydajność CML wynosiła. 120. Mola na mol lizyny. Przyjmując założone założenia, oznacza to, że każdy mol aldehydu glikolowego wytworzył 0,9 mmol CML. Tak więc, nawet w obecności innych konkurencyjnych aminokwasów, aldehyd glikolowy był około 6000 razy bardziej reaktywny niż glukoza. Te obserwacje dodatkowo potwierdzają hipotezę, że konwersja L-seryny do aldehydu glikolowego przez mieloperoksydazę może być fizjologicznie istotną drogą do tworzenia CML. Ludzkie neutrofile generują CML na białkach modelowych. Aby określić, czy neutrofile wykorzystywałyby mieloperoksydazę do wytwarzania CML, inkubowaliśmy komórki z L-seryną w fizjologicznym roztworze soli w obojętnym pH, a następnie dodawano RNazę A i inkubowano mieszaninę reakcyjną przez różne okresy w 37 ° C. HPLC z odwróconą fazą ujawniła, że neutrofile początkowo przekształciły L-serynę w aldehyd glikolowy (dane nie pokazane, odnośnik 28), co sugeruje, że aldehyd był półproduktem w szlaku reakcji. Aminokwasy z hydrolizatu kwasowego RNazy A eksponowanego na aktywowane granulocyty obojętnochłonne derywatyzowano, a następnie analizowano za pomocą jonizacji elektronowej GC / MS (Figura 7). Pochodną kwasu metylo-trifluorowcoetylowego z CML, monitorowaną jako jony przy m / z 392 (M a + A CH3OH) i m / z 305 (M a + A 2 COOCH3 A H), łatwo wykryto w mieszaninie aminokwasów przez wybranie monitorowanie jonów. Względna obfitość i czas retencji jonów pochodzących ze związku wytworzonego przez aktywowane neutrofile były identyczne jak w autentycznym CML
[przypisy: neurolog dziecięcy czym się zajmuje, waiting for forever cda, zasobnik nutowy ]
[patrz też: dieta uderzeniowa naturhouse, brzydula odcinek 188, zastrzyk przeciw tężcowi ]
