Psycholog - czekając na wieczność

Identyfikacja deficytu kurczliwości w komórkach miocytów dorosłych wykazujących ekspresję kardiomiopatii przerostowej związanych ze zmutowanymi białkami T troponiny ad

7 września 2019 by admin

Jednak ostatnie badania dały sprzeczne wyniki dotyczące wpływu zmutowanych białek TnT na szybkość skracania (8, 10, 12) i wrażliwość na skurcz wapnia (10, 13). Jednym kluczowym eksperymentem, który nie został jeszcze wykonany, jest bezpośrednie przetestowanie efektów zmutowanej ekspresji TnT w kontekście dorosłego pojedynczego miocytu serca. Opracowaliśmy eksperymentalny system wykorzystujący zmanipulowane genetycznie komórki miocytów pojedynczego serca w krótkoterminowych pierwotnych hodowlach. Kluczowymi cechami systemu są: (a) stabilne kultury miocytów sercowych dorosłych z niezmienioną strukturą aparatu kurczliwego i funkcją podczas 1-tygodniowego okresu hodowli; (b) wysoce wydajne dostarczanie genu za pośrednictwem adenowirusa; oraz (c) bezpośredni pomiar funkcji kurczliwości mięśnia sercowego pojedynczego mięśnia sercowego (14). To eksperymentalne podejście idealnie nadaje się do bezpośredniego testowania wpływu zmutowanych białek TnT na strukturę miofilamentu i funkcjonowania w kontekście dorosłego miokita serca, umożliwiając wyjaśnienie pierwotnego efektu zmutowanego TnT na strukturę kurczliwości i funkcję. W niniejszym badaniu wytworzono 2 wektory adenowirusowe zawierające związane z HCM zmutowane komórki TnT I79N i R92Q w celu przeniesienia genów do dojrzałych miocytów sercowych. Skupiliśmy się na tych dwóch mutacjach missense z powodu ich złośliwych wyników klinicznych (15), ich przypuszczalnej wspólnej domeny strukturalnej dla interakcji tropomiozyny (7) i odkrycia, że kodon 92 jest pozornym mutacyjnym gorącym punktem (16). Testowano hipotezę, że mutanty I79N i R92Q będą ulegać ekspresji i włączone do sarkomeru i bezpośrednio zmienią wytwarzanie siły aktywowanej wapniem dorosłego pojedynczego miocytu serca. Co ciekawe, poziom ekspresji ektopowej dla zmutowanych TnTs był znacznie mniejszy niż poziom uzyskany dla cTnT typu dzikiego. W pomiarach siły miocytów pojedynczych serc, poziom wapnia wymagany do osiągnięcia połowy maksymalnego napięcia był znacznie zwiększony, co wskazuje na znaczną nadwrażliwość na wapń aparatu kurczliwego. Maksymalne napięcie nie uległo zmianie w tych miocytach. Te odkrycia sugerują, że mutacje I79N i R92Q powodują zmniejszone powinowactwo / stabilność zmutowanego TnT do składania w sarkomery i zmienione wytwarzanie siły przez miocyty w submaksymalnym zakresie stężeń aktywacji mioplasmowego wapnia, tym samym wspierając dominujący negatywny mechanizm działania. Metody Pierwotne hodowle dorosłych miocytów komorowych. Metoda ta została wcześniej szczegółowo opisana (14, 17). Pokrótce, serce zostało usunięte z dorosłego samicy szczura Sprague-Dawley i zamontowane na zmodyfikowanym aparacie perfuzyjnym Langendorffa. Serce perfundowano buforem Krebsa-Henseleita (KHB) (118 mmol / L NaCl, 4,8 mmol / L KCl, 25 mmol / L HEPES, 1,25 mmol / L K2HPO4, 1,25 mmol / L MgSO4 i 11 mmol / L glukozy) zawierający mM Ca2 + przez 5 minut, a następnie perfuzję przestawiono na wolny od Ca2 + KHB (bez dodatku Ca2 +). Po 5 minutach kolagenazę (0,5 mg / ml) i hialuronidazę (0,2 mg / ml) dodano do wolnego od Ca2 + KHB i serce poddawano perfuzji przez 15 minut. Po 15 minutach stężenie Ca2 + w perfundowanym roztworze podniesiono do mM i perfuzję kontynuowano przez kolejne 15 minut. Serce przeniesiono do sterylnej zlewki zawierającej roztwór enzymu (1 mM Ca2 + -KHB + 0,5 mg / ml kolagenazy + 0,2 mg / ml hialuronidazy). Po usunięciu przedsionków komory mrożono delikatnie i inkubowano w łaźni wodnej o temperaturze 37 ° C przez trzy 10-minutowe inkubacje z delikatnym wirowaniem. Pokosty zebrano i odwirowano przez 15 sekund, a komórki ponownie zawieszono w mM Ca2 + -KHB + 20 mg / ml BSA. Po połączeniu komórek z produktów trawienia, roztwór [Ca2 +] zwiększono do 1,75 mM. Komórki wirowano krótko, supernatant usunięto, a komórki ponownie zawieszono w DMEM + 5% FBS + penicylina / streptomycyna (P / S), zliczono i umieszczono na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą (18 mm2) w 2 x 104 miocyty na szkiełko nakrywkowe. Po 2 godzinach pożywkę usunięto i komórki zakażono adenowirusem, jak opisano poniżej lub pożywkę zastąpiono DMEM + P / S bez surowicy. Mutageneza ukierunkowana. Zmutowane białka I79N i R92Q wytworzono przy użyciu zestawu do mutagenezy ukierunkowanej miejscowo QuikChange (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA). Startery stosowane do generowania mutacji I79N były (sensowne) 5 (3-GCCACCCAAGAACCCTGACGGAGAG-3. i (antysensowny) 5 (3 -CTCTCCGTCAGGGTTCTTGGGTGGC-3 .. Startery stosowane do generowania mutacji R92Q były (sensowne) 5 (3-GATGACATCCACCAGAAGCGCATGG-3. i (antysensowny) 5a-CCATGCGCTTCTGGTGGATGTCATC-3 .. Zmiany nukleotydowe, które tworzą mutacje, są podkreślone. Protokół ukierunkowanej mutagenezy przeprowadzono zgodnie z instrukcjami zestawu QuikChange
[podobne: podstawowe potrzeby człowieka, miłosne smsy na dzień dobry, kurczak w zielonym curry ]
[podobne: odrabianko, chirurdzy s09e05, worms revolution spolszczenie ]

Posted in: Bez kategorii Tagged: chirurdzy s09e05, odrabianko, worms revolution spolszczenie

Partnerzy serwisu:



Zobacz tez:

Wpływ regulowanej ekspresji izoform cyklooksygenazy ludzkiej na produkcję eikozanoidów i izoeikosoidów w zapaleniach cd

Następnie monocyty izolowano przez wirowanie w gradiencie gęstości za pomocą Histopaque-1077 (Sigma Chemical Co.) przez 40 minut przy 1200 g. Frakcję jednojądrzastą ponownie zawieszono w PBS i przemywano trzy razy przed jej inkubacją w pożywce RPMI 1640 (GIBCO BRL), 5% dezaktywowanej termicznie FBS, razem z 2 mM glutaminy, 100 U / ml penicyliny i 100 ... [Read more...]

Wirus Chikungunya: epidemiologia, replikacja, mechanizmy chorobowe i strategie prospektywnej interwencji ad 6

Po wystąpieniu gorączki u większości pacjentów rozwija się ciężka i często wyniszczająca wielocentralia, która jest zwykle obustronna i symetryczna, najczęściej w kostkach, nadgarstkach i paliczkach. Inne objawy to zapalenie stawów, astenia, zapalenie spojówek, ból żołądka i jelit, bóle głowy, bóle mięśni i wysypka, która jest zwykle maculopłat i świąd (tabela 1). W ostatnich epidemiach obserwowano ... [Read more...]

Inhibitory deacetylazy histonowej indukują remisję w transgenicznych modelach opornej na leczenie białaczki promielocytowej

Ostra białaczka promielocytowa (APL) jest związana z translokacją chromosomalną, niezmiennie obejmującą receptor kwasu retinowego. Gen (RAR .) połączony z jednym z kilku różnych loci, w tym z genami PML lub PLZF, zaangażowanymi odpowiednio w t (15; 17) lub t (11; 17). Pacjenci z APL (15; 17) dobrze reagują na kwas retinowy (RA) i inne metody ... [Read more...]

DevURL

Polecane:



Tags

antytoksyna asgo poznań brzydula odcinek 188 chirurdzy s09e05 chwytak wikipedia cierpnące ręce dentaria częstochowa dieta uderzeniowa naturhouse genetyka sprawdzian puls życia 3 gwiezdne wrota atlantyda sezon 1 hobbit peb nadzdolni obsada odrabianko pytania quarhodrona ranczo sezon 9 chomikuj saga o ludziach lodu chomikuj sinumax sprawdzian trzecioklasisty obut 2015 thiocodin opinie urszula grabowska nudografia worms revolution spolszczenie zastrzyk przeciw tężcowi

Copyright © 2019 Psycholog - czekając na wieczność.