Jednak ostatnie badania dały sprzeczne wyniki dotyczące wpływu zmutowanych białek TnT na szybkość skracania (8, 10, 12) i wrażliwość na skurcz wapnia (10, 13). Jednym kluczowym eksperymentem, który nie został jeszcze wykonany, jest bezpośrednie przetestowanie efektów zmutowanej ekspresji TnT w kontekście dorosłego pojedynczego miocytu serca. Opracowaliśmy eksperymentalny system wykorzystujący zmanipulowane genetycznie komórki miocytów pojedynczego serca w krótkoterminowych pierwotnych hodowlach. Kluczowymi cechami systemu są: (a) stabilne kultury miocytów sercowych dorosłych z niezmienioną strukturą aparatu kurczliwego i funkcją podczas 1-tygodniowego okresu hodowli; (b) wysoce wydajne dostarczanie genu za pośrednictwem adenowirusa; oraz (c) bezpośredni pomiar funkcji kurczliwości mięśnia sercowego pojedynczego mięśnia sercowego (14). To eksperymentalne podejście idealnie nadaje się do bezpośredniego testowania wpływu zmutowanych białek TnT na strukturę miofilamentu i funkcjonowania w kontekście dorosłego miokita serca, umożliwiając wyjaśnienie pierwotnego efektu zmutowanego TnT na strukturę kurczliwości i funkcję. W niniejszym badaniu wytworzono 2 wektory adenowirusowe zawierające związane z HCM zmutowane komórki TnT I79N i R92Q w celu przeniesienia genów do dojrzałych miocytów sercowych. Skupiliśmy się na tych dwóch mutacjach missense z powodu ich złośliwych wyników klinicznych (15), ich przypuszczalnej wspólnej domeny strukturalnej dla interakcji tropomiozyny (7) i odkrycia, że kodon 92 jest pozornym mutacyjnym gorącym punktem (16). Testowano hipotezę, że mutanty I79N i R92Q będą ulegać ekspresji i włączone do sarkomeru i bezpośrednio zmienią wytwarzanie siły aktywowanej wapniem dorosłego pojedynczego miocytu serca. Co ciekawe, poziom ekspresji ektopowej dla zmutowanych TnTs był znacznie mniejszy niż poziom uzyskany dla cTnT typu dzikiego. W pomiarach siły miocytów pojedynczych serc, poziom wapnia wymagany do osiągnięcia połowy maksymalnego napięcia był znacznie zwiększony, co wskazuje na znaczną nadwrażliwość na wapń aparatu kurczliwego. Maksymalne napięcie nie uległo zmianie w tych miocytach. Te odkrycia sugerują, że mutacje I79N i R92Q powodują zmniejszone powinowactwo / stabilność zmutowanego TnT do składania w sarkomery i zmienione wytwarzanie siły przez miocyty w submaksymalnym zakresie stężeń aktywacji mioplasmowego wapnia, tym samym wspierając dominujący negatywny mechanizm działania. Metody Pierwotne hodowle dorosłych miocytów komorowych. Metoda ta została wcześniej szczegółowo opisana (14, 17). Pokrótce, serce zostało usunięte z dorosłego samicy szczura Sprague-Dawley i zamontowane na zmodyfikowanym aparacie perfuzyjnym Langendorffa. Serce perfundowano buforem Krebsa-Henseleita (KHB) (118 mmol / L NaCl, 4,8 mmol / L KCl, 25 mmol / L HEPES, 1,25 mmol / L K2HPO4, 1,25 mmol / L MgSO4 i 11 mmol / L glukozy) zawierający mM Ca2 + przez 5 minut, a następnie perfuzję przestawiono na wolny od Ca2 + KHB (bez dodatku Ca2 +). Po 5 minutach kolagenazę (0,5 mg / ml) i hialuronidazę (0,2 mg / ml) dodano do wolnego od Ca2 + KHB i serce poddawano perfuzji przez 15 minut. Po 15 minutach stężenie Ca2 + w perfundowanym roztworze podniesiono do mM i perfuzję kontynuowano przez kolejne 15 minut. Serce przeniesiono do sterylnej zlewki zawierającej roztwór enzymu (1 mM Ca2 + -KHB + 0,5 mg / ml kolagenazy + 0,2 mg / ml hialuronidazy). Po usunięciu przedsionków komory mrożono delikatnie i inkubowano w łaźni wodnej o temperaturze 37 ° C przez trzy 10-minutowe inkubacje z delikatnym wirowaniem. Pokosty zebrano i odwirowano przez 15 sekund, a komórki ponownie zawieszono w mM Ca2 + -KHB + 20 mg / ml BSA. Po połączeniu komórek z produktów trawienia, roztwór [Ca2 +] zwiększono do 1,75 mM. Komórki wirowano krótko, supernatant usunięto, a komórki ponownie zawieszono w DMEM + 5% FBS + penicylina / streptomycyna (P / S), zliczono i umieszczono na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą (18 mm2) w 2 x 104 miocyty na szkiełko nakrywkowe. Po 2 godzinach pożywkę usunięto i komórki zakażono adenowirusem, jak opisano poniżej lub pożywkę zastąpiono DMEM + P / S bez surowicy. Mutageneza ukierunkowana. Zmutowane białka I79N i R92Q wytworzono przy użyciu zestawu do mutagenezy ukierunkowanej miejscowo QuikChange (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA). Startery stosowane do generowania mutacji I79N były (sensowne) 5 (3-GCCACCCAAGAACCCTGACGGAGAG-3. i (antysensowny) 5 (3 -CTCTCCGTCAGGGTTCTTGGGTGGC-3 .. Startery stosowane do generowania mutacji R92Q były (sensowne) 5 (3-GATGACATCCACCAGAAGCGCATGG-3. i (antysensowny) 5a-CCATGCGCTTCTGGTGGATGTCATC-3 .. Zmiany nukleotydowe, które tworzą mutacje, są podkreślone. Protokół ukierunkowanej mutagenezy przeprowadzono zgodnie z instrukcjami zestawu QuikChange
[podobne: podstawowe potrzeby człowieka, miłosne smsy na dzień dobry, kurczak w zielonym curry ]
[podobne: odrabianko, chirurdzy s09e05, worms revolution spolszczenie ]
