Western bloty przedstawiające reprezentatywną ekspresję dojrzałych miocytów sercowych zakażonych eTnT-, I79N- i R92Q. Zastosowane przeciwciało było albo przeciwciałem anty-cTnT (MAB 1695, lewe blot) albo przeciwciałem TnT z mięśniami prążkowanymi (T6277, klon JLT-12; prawo blot). Znaczniki migracji przedstawiono między 2-krotnymi (od góry do dołu: izoformą zarodkową, mniejszą dorosłą izoformą i główną dorosłą izoformą). (b) Frakcja całkowitego białka TnT (endogennego aTnT + ektopowego TnT), która jest albo eTnT (n = 19), I79N (n = 23), albo R92Q (n = 20). Przeprowadzono densytometrię skaningową w celu określenia stosunku ektopowego TnT / całkowitego TnT. Bary reprezentują średnią. SE. * Znacząco różni się od eTnT. Figura 3 Porównanie ekspresji białka ektopowego w nietkniętych błonach i próbek miocytów przepuszczalnych przez błonę. Przeprowadzono densytometrię skaningową w celu określenia stosunku ektopowego TnT / całkowitego TnT. eTnT: n = 9 (nienaruszony), n = 11 (permeabilizowany); I79N: n = 11 (nienaruszony), n = 12 (permeabilizowany); R92Q: n = 7 (nienaruszony), n = 13 (permeabilizowany). Bary reprezentują średnią. SE. * Znacząca różnica między nienaruszoną i permeabilizowaną. Dla każdego białka ektopowego porównywano dane nietransfekowane błoną i permeabilizowane przez błonę przy użyciu niesparowanego testu t. P = 0,23 dla eTnT; P = 0,04 dla I79N; i P = 0,57 dla R92Q. Tabela Porównanie całkowitej zawartości TnT w kontrolnych, dzikich i zmutowanych miocytach sercowych wyrażających TnTp kontrolnych, TnTp. Ważne było również sprawdzenie, czy ekspresja wprowadzonych białek wpłynęła na ekspresję innych izoform białkowych, na przykład przez indukcję zmiany izoformy z dorosłego człowieka. do izoformy embrionalnej, co wskazywałoby, że miocyty sercowe ulegały odróżnicowaniu. Kolejne sondowanie Western blot z przeciwciałami przeciwko tropomiozynie i troponinie I przeprowadzono w celu zbadania zmian w ekspresji izoform tych 2 białek. Jak pokazano na fig. 4, normalny wzór ekspresji izoformy dorosłej osoby dorosłej dla troponiny I i a-tropomiozyny nie został zmieniony przez zmutowany transfer genu TnT. Wynik ten zapewnił poparcie dla idei, że zmutowane białka TnT były eksprymowane i włączane do myofilamentów bez powodowania innych nieswoistych zmian w miocytach sercowych. Figura 4 Wzór ekspresji izotomycyny i izoformy troponiny I w miocytach dorosłych po przeniesieniu genu. Western blot i żel wybarwiony srebrem (w celu wykazania obciążenia) kontrolnych, miocytów sercowych dorosłych zainfekowanych AdCMVI79N i zakażonych AdCMVR92Q. Wzorce migracji troponiny I (cTnI), wolnej troponiny I szkieletowej (ssTnI), a-tropomiozyny (a-Tm) i a-tropomyozyny (a-Tm) są przedstawione za pomocą markerów umieszczonych obok figury. Włączenie Sarcomere i ultrastruktura. W celu dalszej oceny włączania sarcomerycznego z ekspresji ektopowo TnTs, dorosłe miocyty sercowe badano stosując podwójne monoklonalne znakowanie immunofluorescencyjne. Miody o kształcie pręcików podwójnie znakowane przeciwciałem anty-TnT i przeciwciałem anty-aktynowym były oceniane jako TnT +, jeśli wykazywały wyraźny prążek w warunkach fluorescencji rodaminy / TR. Dyfuzyjne znakowanie TnT w traktowanych miocytach w porównaniu z kontrolami oznaczałoby, że wprowadzone białko TnT nie zostało odpowiednio włączone do myofilamentu i było niespecyficznie wiązanie lub akumulacja w cytoplazmie. Wyniki pokazały jednak, że sarcomeryczny wzór znakowania TnT pozostał niezmieniony pomiędzy miocytami kontrolnymi i eTnT-, I79N- i R92Q (Figura 5). Nie było znaczącej różnicy między średnimi grup określonymi za pomocą jednoczynnikowej ANOVA (Figura 5), ani nie było jakiejkolwiek zmiany we wzorcu wiązania (3-pektyny pomiędzy grupami (dane nie pokazane), co wskazuje, że ekspresja wprowadzone białka TnT w miocytach sercowych nie zmieniają grubszej struktury sarcomerycznej w porównaniu z kontrolnymi miocytami. Figura 5 Podsumowanie oceny immunofluorescencyjnej miocytów sercowych po przeniesieniu genu. Wykres pokazuje frakcję zliczonych miocytów w kształcie prętów, które wykazały prążkowany wzór barwienia TnT (TnT +). Szczegółowe informacje na temat szkiełek nakrywkowych znajdują się w Methods. Liczba badanych szkieł nakrywkowych była następująca: kontrola = 3; eTnT = 7; I79 = 11; i R92Q = 11. Słupki oznaczają średnią. SE. Analiza obrazu w mikroskopie konfokalnym wykazała również, że struktura sarcomeryczna była identyczna między kontrolnymi miocytami i miocytami eksprymującymi eTnT, I79N lub R92Q (Figura 6). Wyniki te potwierdzają wniosek, że eksprymowane białko TnT jest włączone do miofilamentu i nie wpływa na charakterystyczną okresowość sarcomeryczną na całej długości i przekroju miocytu. Figura 6 Reprezentatywne obrazy konfokalne miocytów znakowanych przez pośrednią immunofluorescencję dla TnT
[patrz też: podstawowe potrzeby człowieka, neurolog dziecięcy czym się zajmuje, waiting for forever cda ]
[przypisy: dentaria częstochowa, hobbit peb, antytoksyna ]
